Beratungsleistungen von BOEHM BIOECH CONSULTING

BOEHM BIOTECH CONSULTING bietet hochwertige und individuelle Beratung auf vielen wissenschaftlich-technischen Gebieten der Biomedizin und der Biotechnologie an. Die wesentlichen Themen hier sind:

  • Die Alzheimer-Erkrankung: Diagnostik und Therapieansätze
  • Bioinformatik, Datenbanken, Proteinstrukturrechnung, Strukturmodellierung
  • Drug Delivery-Systeme: Transport von Wirkstoffen und Nukleinsäuren

 

 

Die Alzheimer-Erkrankung: Diagnostik und Therapieansätze

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Die Alzheimer-Erkrankung bildet den inhaltlichen Schwerpunkt der Beratung bei BOEHM BIOTECH CONSULTING. Hier biete ich umfangreiche Erfahrungen und Kontakte sowie eigenes Wissen. Insbesondere im Bereich der frühzeitigen und kausalen Diagnostik der Erkrankung habe ich gemeinsam mit meinem Team wissenschaftlich und technisch herausragende Lösungen erarbeitet. Etwa 70 % unserer Kundenaufträge betreffen den Bereich der Alzheimer-Diagnostik.

Die Alzheimer-Erkrankung (AD, Alzheimer’s Disease) gehört zu den drei Haupt-Erkrankungen in der westlichen Welt, neben Tumoren und Herz/Kreislauferkrankungen. Sie ist ein globales Problem und betrifft rund 10 % der über 65-Jährigen und über 25 % der über 85-Jährigen; praktisch jede Person, die alt genug wird und nicht an einer anderen Erkrankung stirbt, wird letztendlich an Alzheimer erkranken. Rund ⅔ aller Hirnleistungsstörungen (Demenzerkrankungen) im Alter sind auf die Alzheimer-Erkrankung zurückzuführen. Derzeit gibt es noch keine zuverlässige laborgestützte Diagnose der Erkrankung und keine kausale Therapie; jedoch sind vielversprechende therapeutische Ansätze im Bereich der Vakzinierung (Impfstoffe) gegen die Alzheimer-Erkrankung in finalen klinischen Studien. Eine biochemische Diagnose der Alzheimer-Erkrankung, die insbesondere die Frühformen vor dem Auftreten schwerer klinischer Symptome detektieren kann, existiert derzeit nicht. Eine Alzheimer-Diagnose erfolgt heute über den Ausschluss anderer Krankheiten und wird über kognitive und bildgebende Verfahren ausgeführt. Einschränkend muss angemerkt werden, dass die Alzheimer-Erkrankung derzeit erst diagnostiziert werden kann, wenn sie ausgebrochen und so weit fortgeschritten ist, dass sich die typischen klinischen Symptome zeigen. Eine gesicherte und eindeutige Diagnose ist bislang erst post mortem durch eine Untersuchung des Gehirns – nach Autopsie – möglich.

Die Alzheimer-Erkrankung ist auf einen „natürlichen“ Prozess zurückzuführen und damit ab einem gewissen Alter praktisch unvermeidlich. Sie ist durch deutliche pathologische Veränderungen des Gehirns charakterisiert und führt zu einem – derzeit noch unaufhaltsamen – Abbau der kognitiven Fähigkeiten bei den Patienten. Die Alzheimer-Erkrankung ist nach ihrem Ausbruch nicht mehr heilbar, da Gehirnzellen irreversibel zerstört werden. Jedoch kann bei rechtzeitiger Therapie mit den heute bereits zugelassenen Medikamenten eine Verlangsamung des Fortschritts und eine Unterdrückung der Symptome erzielt werden. Einen Durchbruch im Bereich der Therapie werden die impfstoffbasierten Therapeutika bringen, die sich bei vielen Ansätzen bereits in der klinischen Prüfung befinden. Die typischen Ablagerungen (Plaques) im Gehirn eines Alzheimer-Patienten entstehen über einen Zeitraum von mehreren Jahrzehnten (symptomatisch unauffällige Vorlaufphase). Patienten durchleben die spontane Variante der Alzheimer-Erkrankung in einem Zeitraum von 6 bis 20 Jahren, wobei die Mehrzahl sieben Jahre nach Ausbruch der Erkrankung an deren Folgen stirbt.

Mein Team konnte im Rahmen unserer Forschungen der vergangenen Jahre schlüssig zeigen, dass Aβ-Oligomere eine kausale Ursache für die Erkrankung sind. Die sogenannte erweitere Amyloid-Beta-Hypothese, die von vielen weiteren namhaften Forschungsgruppen unterstützt wird, kann viele bislang unklare Phänomene bei der Alzheimer-Erkrankung erklären und wird zunehmend in der wissenschaftlichen Literatur akzeptiert. Die von uns beschriebenen löslichen Oligomere sind reifende Vorformen der Fibrillen, die später im Gehirn von AD-Patienten gefunden werden. Sie sind neurotoxisch und zerstören dadurch Gehirnzellen in essenziellen Bereichen. Jedoch ist die Konzentration dieser löslichen Oligomere extrem gering, daher hat die Erkrankung eine besonders lange Vorlaufzeit vor dem Ausbruch.

Bioinformatik, Datenbanken, Proteinstrukturrechnung, Strukturmodellierung

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Ein wichtiger Kompetenzbereich von BOEHM BIOTECH CONSULTING liegt in der molekularen Bioinformatik. Die Menge und die Komplexität der Informationen in der biologischen Forschung nehmen laufend und rasant zu. Viele dieser Informationen und Daten sind in traditionell strukturierten Datenbanken organisiert und stehen der Forschung über das Internet zur Verfügung. Unter den neu gewonnenen Daten haben die Genomsequenzen zweifellos den bedeutendsten Anteil. Jedoch haben auch Strukturinformationen eine zentrale Bedeutung für die moderne Pharmakologie.

Eine zentrale Aufgabe der Bioinformatik besteht in der Organisation dieser komplexen und großen Datenmengen, aber auch in der Aufdeckung neuartiger Informationszusammenhänge im Sinne eines data mining. Die durch Gensequenzierung erhaltenen Informationen sind in vielen Fällen nur dann wirtschaftlich verwertbar, wenn die funktionelle Bedeutung einer bestimmten (Gen-)Sequenz aufgeklärt wird. Die exprimierten Proteine des zellulären Proteoms bilden den zentralen Mittelpunkt biologischer Prozesse.

Der Schlüssel zum Verständnis der biologischen und funktionellen Eigenschaften von Proteinen liegt in ihrer Struktur begründet. Life Sciences-Unternehmen benötigen diese strukturellen Eigenschaften beispielsweise zur Einschätzung von eigenen experimentellen Arbeiten und für Erfindungen und Patente.

Die Struktur eines gegebenen Proteins wird meist experimentell bestimmt. Dies erfordert jedoch einen hohen Zeit- und Kostenaufwand, und ein (schneller) Erfolg ist nicht garantiert. Ein Computerverfahren zur Modellierung der Struktur kann dagegen rasch und kostengünstig erfolgen und bereits vor der aufwendigen experimentellen Strukturaufklärung wesentliche Eigenschaften des untersuchten Zielproteins korrekt darstellen. Die Erstellung solcher Strukturmodelle ist Teil der modernen molekularen Bioinformatik; das Faltungsproblem, also die Vorhersage der Tertiärstruktur von Proteinen aufgrund von Sequenzinformationen, gilt heute noch immer als die Königsdisziplin der Bioinformatik. Bis heute ist noch nicht verstanden, nach welchem Mechanismus sich eine gegebene Aminosäuresequenz zu einer nativen und funktionellen Protein-Tertiärstruktur faltet, somit existiert auch kein eindeutiger mathematischer Algorithmus zur Ableitung der Tertiärstruktur anhand von Sequenzinformationen.

Aus diesen Gründen werden bei Vorhersagen der Tertiärstruktur von Proteinen wissensbasierte Ansätze zugrunde gelegt, die derzeit als die zuverlässigsten Verfahren zur Strukturprognose angesehen werden. Hierbei wird versucht, bei Kenntnis der Sequenz eines unbekannten Proteins und einer dazu „verwandten“ Templatstruktur durch Vergleichende Modellierung (homology modeling) auf ein Tertiärstrukturmodell zu schließen. Eine bislang unbekannte Faltungstopologie kann daher nicht vorhergesagt werden. Es wird jedoch erwartet, dass binnen der nächsten Jahre im Rahmen der Initiative „structural genomics“ alle relevanten natürlichen Topologien bekannt sein werden; völlig neuartige Proteintopologien sind danach kaum mehr zu erwarten.

Die üblicherweise eingesetzten Verfahren der Vergleichenden Modellierung sind ab einem bestimmten Verwandtschaftsgrad (etwa 50 % Sequenzidentität von unbekanntem Protein und Templat) relativ robust und zuverlässig, können aber auch dann Details wie beispielsweise Unterschiede in der Elektrodynamik im aktiven Zentrum eines Proteins nur mit begrenzter Auflösung darstellen. Es ist daher sehr wichtig, zu jedem Tertiärstrukturmodell auch dessen Zuverlässigkeit zu bestimmen, damit eine Überinterpretation der Modelle ausgeschlossen ist.

Nach der Bereitstellung einer qualitativ hochwertigen Datenbank der humanen Genomsequenz und anderer wichtiger Genome wird der nächste große Schritt die Bestimmung wichtiger biologischer Funktionen der Bestandteile des zellulären Proteoms liegen. Hierzu kann die molekulare Bioinformatik mit ihrer anspruchsvollsten Disziplin, der Tertiärstrukturvorhersage von Proteinen anhand der Sequenz, wertvolle Hilfestellungen leisten.

BOEHM BIOTECH CONSULTING setzt die erfolgreichen und hochrangig publizierten wissenschaftlichen Forschungsergebnisse von Dr. Gerald Böhm im Bereich der Modellierung und der Proteinstrukturvorhersage in die Praxis um. Gerne unterstütze ich Sie durch diese nachgewiesene Expertise im Bereich der Bioinformatik und der wissensbasierten Strukturmodellierung von Proteinen für Ihre laufenden oder zukünftig geplanten Projekte. Sprechen Sie mit mir, gerne helfe ich Ihnen bei Ihren Projekten kompetent weiter!

Drug Delivery-Systeme: Transport von Wirkstoffen und Nukleinsäuren

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BOEHM BIOTECH CONSULTING besitzt umfangreiche Erfahrungen mit einem proteinbasierten Transfektionssystem sowie den nachstehend genannten Forschungs- und Entwicklungsfeldern. Darüber hinaus kann ich Ihnen auch nachgewiesene Expertise bei hyperthermophilen Proteinen im Allgemeinen sowie dem Einsatz von Proteinen im Bereich der Therapie und des Drug Delivery anbieten. In der Pharma- und Gentechnologieforschung werden verschiedene Produkte (Wirkstoffe) zur Behandlung von Krankheiten entwickelt. Für viele dieser Therapieprodukte ist es vorteilhaft oder sogar essenziell, die Wirkstoffe direkt und spezifisch zu den zu behandelnden Zellen zu bringen. Bei der Behandlungsmethode der Gentherapie sollen funktionsfähige Gene in die betroffenen (beispielsweise zu Krebszellen entarteten oder disfunktionalen) Zellen des Körpers eingeschleust werden, um dort die Zellen abzutöten (im Falle von Tumortherapien) oder die geschädigten Gene funktionell zu ersetzen. So kann die grundlegende Ursache der Krankheit beseitigt und damit der Patient geheilt werden. Diese spezifische Strategie weist gegenüber vielen, lediglich symptomatisch orientierten Therapieansätzen offenkundige Vorteile auf. Andere Medikamente wie beispielsweise Antibiotika werden dem Patienten systemisch verabreicht, verteilen sich über die Blutbahn im gesamten Körper und gelangen so unter anderem auch – in dann geringer Menge – zu ihrem jeweiligen Ziel. Jedoch ist bei dieser Form des Drug Delivery die Belastung des Körpers durch die sich im Umlauf befindlichen Wirkstoffe relativ hoch, da diese nicht nur die gewünschten Zellen, sondern ebenso auch andere Zellen in ihrer Funktion beeinflussen. Diese unerwünschten Nebeneffekte können vermieden werden, wenn die Gene oder andere Pharmazeutika (Arzneistoffe, Hormone, Proteine, Peptide, Nukleinsäurefragmente wie antisense-Oligonukleotide oder Ribozyme, etc.) effizient zu den vorgesehenen Zellen transportiert, in diese eingeschleust, und die therapeutischen Bestandteile dort freigesetzt werden. Zum Transfer von Nukleinsäuren (DNA, RNA) in Zellen können beispielsweise Protein-Nukleinsäure-Assoziate verwendet werden, oder es können Fusionsproteine hergestellt werden, die ein therapeutisch wirksames Protein in Zellen dirigieren. Als Basis für das von meinem Team entwickelte Transportsystem wird das Protein HU aus dem hyperthermophilen Organismus Thermotoga maritima verwendet (TmHU). Die TmHU-Technologie ist für vielfältige Anwendungsgebiete hervorragend geeignet; beispielsweise kann sie bei DNA-basierten Vakzinierungen sowie bei siRNA-basierten Therapieansätzen höchst nutzbringend eingesetzt werden. Mögliche Einsatzgebiete können auch CRISPR/CAS-Therapiesysteme zum Genediting sein.

Das histon-ähnliche HU-Protein aus dem marinen hyperthermophilen Eubakterium Thermotoga maritima (TmHU) wurde in den vergangenen Jahren nahezu ausschließlich in der Arbeitsgruppe von Dr. Gerald Böhm an der Universität Halle sowie in der von ihm gegründeten Firma ACGT ProGenomics AG bearbeitet; alle wesentlichen funktionsbeschreibenden Veröffentlichungen stammen von dieser Arbeitsgruppe. HU-Proteine bilden supramolekulare Nukleoproteinkomplexe; ihre biologische Hauptaufgabe liegt in der Kondensation oder Verpackung von DNA in Bakterienzellen. Neben der Kondensation von DNA schützt es diese vor thermischer Denaturierung und DNase-Abbau.

TmHU hat als hyperthermophiles Protein hierfür außergewöhnliche Eigenschaften. Der Schmelzpunkt des dimeren Proteins liegt bei 95 °C. Bei der Synthese von TmHU kann deshalb in einem ersten Reinigungsschritt eine effektive Präzipitation der Wirtsproteine durch Hitzefällung erfolgen. Im Rahmen von FuE-Arbeiten wurde ein Verfahren entwickelt und optimiert, um TmHU im Wirtsbakterium Escherichia coli durch Fermentation im 10-Liter-Maßstab bereitzustellen; aus einem Fermentationsansatz werden dabei ohne weitere Optimierung rund 2 Gramm hochreines Protein (nach optimaler Endotoxinabreicherung) gewonnen. Mittels Lyophilisation kann das Protein für die weitere Lagerung über sehr lange Zeit stabilisiert werden; die hyperthermophile Natur des Proteins verhindert jeden Aktivitätsverlust während dieser Lagerungsphase.

Es wurde gezeigt, dass TmHU in der Lage ist, mit beliebiger RNA – insbesondere auch mit typischer siRNA – zu interagieren und diese vor dem Verdau durch Nukleasen effizient zu schützen. Eine spezielle Sequenz oder Sekundärstruktur der RNA ist für eine Bindung von TmHU nicht erforderlich; TmHU besitzt jedoch auch ein spezifisches Bindungsmotiv für die Alu-Domäne einer kleinen zytoplasmatischen RNA, was für spezifische Anwendungsszenarien vorteilhaft sein kann. TmHU wird alleine oder gemeinsam mit den daran gebundenen Nukleinsäuren in das Innere von Zellen transportiert, wobei es überwiegend zytoplasmatisch, aber auch im Zellkern, jeweils für bis zu 96 Stunden nachweisbar ist. Üblicherweise sind in Monolayer-Zellkulturen Transportraten bis zu 100 % der vorhandenen Zellen zu beobachten.

Ein toxischer Effekt des gereinigten Proteins ist dabei nicht zu verzeichnen; die Apoptose/Nekrose-Rate bei typischen Zellkulturexperimenten liegt unter 3 % bei Einsatz von TmHU in sehr hohen Konzentrationen (1 mg/ml). In Tiermodellen, die gemeinsam mit dem RIKEN Institut in Japan durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass das Protein bei Injektion in Muskelgewebe gut verträglich ist. Andere Tiermodelle zeigten bei ersten Betrachtungen keine besonderen Nebenwirkungen bei der Injektion, eine detaillierte Analyse – insbesondere eine Erfassung des Immunstatus und allergener Effekte – steht aber derzeit noch aus.

Insbesondere ist TmHU in der Lage, den Transfer von siRNA in humane Zellen zu vermitteln. Dabei ist die Verteilung der RNA zytoplasmatisch vesikulär. Durch FACS-Analysen wurde nachgewiesen, dass bis zu 44 % der Zellen in Zellkultur durch TmHU/siRNA-Komplexe transfiziert werden. Dies liegt um ein Mehrfaches über der Aufnahme von siRNA ohne die Hilfe von TmHU. Es wird nach vorsichtigen Schätzungen angenommen, dass sich die Aufnahmerate durch zelltypspezifische Optimierungen auf über 80 % steigern lässt. Variable Faktoren für diese Optimierungen sind jeweils Protein/Nukleinsäurekonzentrationen, pH-Wert, Inkubationsbedingungen, Calcium-Konzentrationen, und die Verwendung von endosomolytischen Additiven.

Ein RNAi-Effekt ist auch bei gleichzeitigem Einsatz des Transfektionsagens Lipofectamine zu beobachten, TmHU ist daher auch als Verstärker einer Lipofektion einsetzbar. Durch den Zusatz von Calciumionen in das Transfektionsmedium bei der Transfektion von siRNA mit TmHU erfolgt die Ausbildung von Präzipitaten, die einen RNAi-Effekt in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration zeigen.

Weiterhin kann TmHU als Transfektionsagens für übliche Standardplasmide, beispielsweise im Rahmen von Vakzinierungen, genutzt werden. In Modellen zum Transfer eines eGFP-Plasmids in Zellkulturen wurden Effizienzen von rund 30 % (nach Endosomolyse duch Chloroquin) bzw. 31 % (nach Endosomolyse durch die Variante E5 des fusogenen Peptids von Hämagglutinin HA2 aus dem Influenza-Virus, das C-terminal an TmHU gekoppelt wurde), erreicht. Die letztere Variante wird für therapeutische Anwendungen präferiert, da therapeutische Formulierungen auf Basis von diesem TmHU-Fusionsprotein deutlich einfacher herzustellen sind.

Die außergewöhnlichen Eigenschaften von TmHU sind die Basis für ein effizientes Gentransfersystem für DNA und RNA in humane Zellen, das auf dem Markt derzeit einzigartig wäre. Ein konkurrierendes System, das alle vergleichbaren Eigenschaften gegenüber TmHU aufweist, existiert derzeit nicht. Gerne berate ich Sie, wie Sie das TmHU-System für Ihre speziellen Anwendungen modifizieren und einsetzen können. Das TmHU-Transportsystem wurde in der Vergangenheit bereits für eine Vielzahl von Applikationen erfolgreich eingesetzt. Gerne beraten wir Sie bezüglich anderer Anwendungsmöglichkeiten der Technologie.

Folgende Anwendungen wären dabei denkbar:

  • Bereitstellung eines hoch potenten Adjuvans für DNA-basierte Vakzinierungen, beispielsweise gegen Infektionserkrankungen, aber auch gegen Tumore (Tumorvakzinierungen). Als erstes Tiermodell in diesem Kontext wurde hier ein Glioblastom-Mausmodell entwickelt.
  • Bereitstellung eines Hilfsstoffs zum effizienten Transport von siRNA, antisense-RNA, PNA, etc. in Zellen (Zellkultur) für Anwendungen (in vitro) im Bereich der Forschung und Entwicklung.
  • Bereitstellung eines Hilfsstoffs zum effizienten Transport von siRNA oder antisense-RNA in Zellen im Rahmen von entsprechenden therapeutischen Verfahren, insbesondere bei lokalen, nichtsystemischen Anwendungsfällen.
  • Transfektion von Pflanzenzellen (Protoplasten); auch hier konnten erfolgreiche Vorversuche abgeschlossen werden.
  • Transfektion von extrem sensitiven Zellen, die bislang nicht mit anderen Transfektionssystemen erfolgreich transfizierbar waren.
  • Hoch effizienter Transport von Proteinen in Zellen (Fusionsproteine mit TmHU). Als Modell wurde ein TmHU-eGFP-Fusionsprotein hergestellt, das in Zellkultur eingesetzt wurde und in ca. 100 % der Zellen aufgenommen wurde.
  • Unterstützung von Lipofektionsprotokollen; Effizienzsteigerung von Lipofektion. Es konnte gezeigt werden, dass TmHU die Effizienz von Lipofektion regelmäßig um ein Vielfaches steigert. In einzelnen Versuchen wurden hierbei Steigerungsraten um das Hundertfache beobachtet. Dieser Effekt beruht vermutlich auf einer effektiven Kondensation der Nukleinsäuren.
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